脓毒症(sepsis)具有患病率高、病死率高、治疗费用高等特点1-3,是目前重症医学领域最受关注的临床难题之一。而脓毒症的发病机制仍欠清晰,免疫功能紊乱尤其是免疫功能抑制被认为是脓毒症发病的重环节,其中免疫细胞凋亡与免疫功能抑制密切相关,抑制免疫细胞凋亡能有助于改善机体免疫功能,进而高生存率4。范震等5的研究结果显示microRNAs(miRNAs) 参与脓毒症的发病过程。有研究结果表明,microRNA-29a (miR-29a)参与肿瘤细胞凋亡的调控,而关于miR-29a对免疫细胞状态的影响及其机制的研究,目前仍缺乏报道。本研究采用内毒素脂多糖(LPS)诱导人单核细胞株THP-1,模拟脓毒症免疫细胞炎症反应过程,并通过细胞转染的方法,将 miR-29a的拟似物(mimic)或抑制剂(inhibitor)导入细胞内,上调或下调细胞内miR-29a的表达水平,进而观察细胞凋亡水平的变化并探讨其相关分子机制,为阐明miRNAs在脓毒症中的作用及寻找脓毒症干预的新靶向供实验依据。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  人单核细胞系(THP-1)细胞株和人胚肾细胞株293T(购自上海细胞库)。内毒素(LPS)(购自美国Sigma公司);RPMI-164培养基、DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇(购自美国GIBCO公司);Lipofectamine RNAiMAX、Lipofectamine 2、Trizol、SYBR Green qPCR 试剂盒均购自Invitrogen公司; Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(购自南京凯基生物公司);报告基因活性检测试剂盒(Dual-Luciferase? Reporter Assay System, Promega);pGL3-control-MCS和Renilla luciferase质粒(Invitrogen公司),内切酶和连接酶(美国Fermentas公司),质粒取试剂盒(美国Omega)。
  1.2 方法
  1.2.1 细胞培养及传代方法 将THP-1细胞置于含1%胎牛血清的RPMI164培养基中,于37 ℃、5% CO2培养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系,在培养液中呈簇集状悬浮生长,细胞含量控制在1×16/ml,每2 d换液一次,每4 d传代一次。细胞复苏后,传至3~5代后用于实验。细胞用含1%胎牛血清的DMEM培养基培养,待细胞贴壁融合率达到8%时进行转染。
  1.2.2 实验分组 将按1.2.1项操作所得THP-1细胞分为正常对照组(CON组)、LPS组(加入LPS 1 μg/ml诱导细胞,相应CON组用PBS代替LPS,诱导24 h后收集细胞检测)、miR-29a拟似物转染组(简称miR-29a mimic组,转染48 h后收集细胞检测),miR-29a拟似物转染对照组(negative control组,简称NC组,转染48 h后收集细胞检测),miR-29a抑制剂转染组(简称miR-29a inhibitor组,转染48 h后收集细胞检测)。
  1.2.3 寡核苷酸序列设计与合成 miR-29a的拟似物(mimic)根据其成熟体序列(miRBase accession No.MI87)合成。miR-29a的抑制剂则采用 miR-29a成熟体的反向互补序列,并对所有碱基都进行 2’-甲氧修饰(由吉玛公司设计)。双链 RNA 的负对照(NC)为与哺乳动物基因组没有同源性的序列,该序列的设计和所有核苷酸的合成均由上海吉玛公司完成。所有PCR引物均由上海英骏生物公司合成(表1)。
  1.2.4 载体构建 Bcl-2 和 Mcl-1 3’UTR 报告基因载体 pGL3-BCL2-3’UTR-Wt 和pGL3-MCL1-3’UTR-Wt 携带野生型(wild type, Wt)的 3’UTR,而 pGL3-BCL2-3’UTR-Mut 和pGL3-MCL1-3’UTR-Mut 则携带突变了 miR-29 识别元件的 3’UTR(突变体,Mutation, Mut)。所有载体均以 pGL3-control-MCS为基础,在 ApaI 和 XbaI 的酶切位点间插入野生型或突变型的 Bcl-2 和 Mcl-1 3’UTR 序列获得的。野生型插入片段的模板是 BCL2 基因(NM_633)和 MCL1 基因(NM_2196)的 3’UTR。突变型插入片段的模板是以野生型载体为基础,在 PCR 扩增使用的引物上引入突变位点,在分别扩增突变位点上下游两段序列后,通过融合 PCR及酶切产生6。
  1.2.5 细胞转染和报告基因活性检测 miRNA的单独转染采用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX。以6孔板为例,THP-1细胞更换新鲜的RPMI 164培养基(不含FBS和抗生素)每孔2 ml。将miRNA稀释于2 μl Opti-MEM培养基中;每管加入8 μl Lipofectamine RNAi MAX,轻柔混匀,室温放置15 min;将 RNAi MAX与siRNA的稀释液加入 6孔板的各孔细胞中,混匀后培养箱中培养48 h,48 h后按实验需处理细胞。miRNA的终浓度为1 nmol/L。转染后24 h加LPS,加LPS后24 h收集样本。
  在双荧光素酶报告系统(luciferase)实验中转染 293T 细胞首先在转染前一天,细胞先传代铺于48 孔板培养(用不含FBS和抗生素的DMEM培养基),铺板后24 h,用Lipofectamine 2 进行转染,将小分子 RNA 和表达质粒稀释于25 μl opti-MEM 中,轻柔混匀;将1 μl Lipofectamine 2稀释于25 μl opti-MEM 中,混匀,室温放置 5 min;将上两液混合,室温放置 2 min;然后加入 48孔板各孔的细胞中, RNA的浓度为 1 nmol/L, firefly luciferase质粒1 ng,Renilla luciferase 质粒 2 ng,混匀后培养箱中培养6 h,更换培养基(含1%FBS的DMEM)再培养42 h后收集细胞,按照报告基因活性检测试剂盒按说明书,用化学发光法检测酶活性。
  1.2.6 RNA取及real time RT-PCR 细胞总 RNA 取按 Trizol 试剂盒说明书操作;使用invitrogen的逆转录反应试剂盒,按试剂盒说明书进行,反应产物置于-2 ℃保存备用或立即进行PCR扩增;PCR过程按invitrogen的SYBR Green qPCR 试剂盒说明书在ABI 75荧光定量PCR仪上进行,使用18S作为内参照同时进行PCR,获得Ct值后,应用比较Ct法进行相对定量,目标基因的相对定量用2-△△Ct计算。
  1.2.7 细胞凋亡水平检测(Annexin V-FITC 染色法) 收集细胞时直接将悬浮生长的THP-1细胞轻轻吹打混匀,收集细胞悬液,5 r/min 4 ℃离心1 min,弃上清液。将细胞悬于标记缓冲液中。然后,加入 Annexin V-FITC,避光室温反应 15 min。加入标记缓冲液,用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。
  1.3 统计学方法
  采用SPSS 13. 统计软件进行数据的分析处理,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间差异只有两组时用成组t检验,有多组时用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。以P<.5为差异具有统计学意义。   2 结果   2.1 过表达miR-29a促进THP-1细胞凋亡   THP-1细胞转染miR-29a mimic 1 nmol/L后,经流式细胞仪检测,与NC组比较,细胞存活率由82.62%下降至57.94%,示THP-1细胞过表达miR-29a可导致细胞凋亡水平增加(图1)。   2.2 下调miR-29a的表达水平能抑制LPS诱导的THP-1细胞凋亡   THP-1细胞先转染miR-29a 的抑制剂1 nmol/L,24 h后再用LPS(1 μg/ml)诱导,与单纯用LPS(1 μg/ml)诱导比较,抑制剂组细胞的存活率增高(由48.5%高至61.91%),示下调THP-1细胞miR-29a的表达水平可抑制LPS诱导的细胞凋亡(图2)。   2.3 过表达miR-29a后 Bcl-2 和Mcl-1的表达下降   THP-1细胞转染miR-29a 1 nmol/L 48 h后,用real time RT-PCR检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA的表达水平,结果示,与CON组和NC组比较,Bcl-2 和Mcl-1的mRNA表达水平均下降,降至(.55±.12)和(.65±.6),P<.5,示过表达miR-29a,能使 Bcl-2 和Mcl-1的表达水平下降(图3)。   2.4 双荧光素酶报告基因系统验证miR-29a的靶基因   293T细胞同时转染miR-29a的mimics和Bcl-2 (或Mcl-1)的报告基因载体(Wt野生型和Mut突变体),结果显示,与对照组比较,转染Bcl-2或Mcl-1野生型(Wt)载体的细胞荧光素酶活性下降,分别由(1.7±.18)和(1.±.3)降至(.63±.12)和(.58±.1),P<.5,而突变型载体(Mut)未见变化(P>.5)。结果示miR-29a能特异性地与Bcl-2和Mcl-1基因的3’UTR的种子序列结合,降解Bcl-2和Mcl-1的mRNA(图4)。
  3 讨论
  脓毒症的发病机制异常复杂,涉及感染、炎症、免疫、凝血、细胞凋亡以及神经-内分泌异常等一系列问题,并与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关7。免疫功能紊乱尤其是免疫功能抑制被认为是脓毒症发病的重环节,其中免疫细胞凋亡是脓毒症免疫抑制状态发生的一个重机制,直接影响脓毒症患者的转归和预后8,可能为临床干预供新的靶点和契机。Hotchkiss等9发现,通过脓毒症鼠过度表达Bcl-2基因,几乎可以完全阻止脓毒症所诱导的淋巴细胞凋亡。由此预测,调控Bcl-2相关的细胞凋亡过程,有可能改变脓毒症的免疫功能状态。
  miRNAs是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA,它可通过识别靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR),并与之结合阻止翻译或导致mRNA降解,从而抑制靶基因的表达1-12。Taganov等13用LPS刺激人单核细胞,miRNA芯片检测发现miR-146a、miR-155和miR-132的表达量增高,并证实LPS是通过TLR4的信号通路调控miRNAs的表达变化,其中miR-146a是以IRAK-1(IL-1受体相关激酶1)和TRAF6(TNF受体相关因子6为靶点,通过调节NF-κB来实现对TLR4/IL-4信号途径的负调控;曾振国等14研究应用LPS刺激NR8383肺泡巨噬细胞,miR-146a的表达上调,且随着刺激时间的延长,miR-146a的表达有增高的趋势。Pauley等15则通过转染miR-146a拟似物进入THP-1细胞,证实可以下调由LPS诱导的细胞因子表达,但关于miRNA对脓毒症的发病过程的报道目前仍较缺乏。
  Xiong等6的研究结果表明,miR-29参与肿瘤细胞的凋亡调控,在肝癌细胞中miR-29的表达水平降低,在肝癌细胞中过表达miR-29能促进肝癌细胞的凋亡,但miR-29能否调控免疫细胞凋亡,目前国内外未见报道。本实验先用LPS 诱导THP-1 细胞,能使细胞的凋亡水平增高,证实LPS能诱导THP-1 细胞凋亡。再通过细胞转染的方法,将合成的miR-29a的拟似物导入THP-1细胞中,达到过表达miR-29a的目的,结果显示THP-1的细胞凋亡水平增高,这与LPS诱导THP-1 细胞凋亡的效应类似;接着,THP-1 细胞先转染miR-29a 的inhibitor,阻断细胞内miR-29a的作用,再用LPS诱导细胞,结果细胞凋亡水平较单纯用LPS刺激降低,示阻遏miR-29a的作用,能抑制LPS诱导的细胞凋亡。本研究应用生物信息学软件Targetscan,寻找miR-29a直接作用的靶点,发现抗凋亡基因Bcl-2 和Mcl-1的mRNA序列中,它们的3’UTR非编码区有能与miR-29a结合的种子序列,因此,在THP-1中过表达miR-29a后,用real time RT-PCR方法检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA表达水平,结果发现它们的表达水平下降,示过表达miR-29a能抑制Bcl-2 和Mcl-1表达;Luciferase 实验证实,miR-29a可特异性抑制带有 Bcl-2 和Mcl-1 3’UTR上野生型识别元件的报告基因表达(P<.5),证实了Bcl-2 和Mcl-1是miR-29a的靶基因,这与Xiong等6的研究结果一致。  综上所述,miRNA参与脓毒症细胞免疫功能调节过程,本研究结果显示miR-29a能通过靶向于两个抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1调控THP-1细胞凋亡水平,示miR-29a在调控免疫细胞的凋亡过程中具有重的作用,借助miR-29a进行免疫细胞凋亡水平调控,有望能改善脓毒症免疫细胞功能状态。     

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